Les principes de la chromatographie

Les principes de base de la chromatographie
expliqués par la théorie des plateaux

Commencez par entrer le nombre de composés à injecter sur la colonne, et le nombre de plateaux de la colonne (ces deux nombres ont été limités à 4 et 2000, afin d'éviter des temps de calculs excessifs) :

Nombre de composés (1 à 4):

Nombre de plateaux (10 à 2000):

Remarque : Dans cette application, nous supposons que le nombre de plateaux d'une colonne est identique pour tous les composés. En réalité, ce n'est pas toujours le cas.

Saisissez maintenant le coefficient de partition de chaque composé.

Coeff. de partition = (Concentration dans la phase stationnaire / Concentration dans la phase mobile)

...dans chaque plateau de la colonne.

Composé 1 :

Tableau d'équilibration pas-à-pas:

Le tableau ci-dessous montre la concentration du (des) composé(s) dans la phase stationnaire et mobile de la colonne.

Au début, toute la concentration (100%) se trouve dans la phase mobile du plateau no.1, car les composés sont injectés avec cette phase.

Vous pouvez commencer par équilibrer la colonne, plateau par plateau, en appuyant sur le bouton "Equilibrer".

Après une étape d'équilibration, vous pouvez pousser la phase mobile. La phase mobile avancera jusqu'au prochain plateau, emportant avec elle sa concentration en produit. Une fois que vous aurez poussé la phase mobile, vous pourrez procéder à une nouvelle étape d'équilibration de la même façon que précédemment.

Défilement auto. du tableau

Calculs en cours!

Cliquer ici pour avoir plus d'informations sur le tableau ci-dessus.

Les calculs dans le tableau ont été légèrement simplifiés par rapport à l'article de Martin et Synge. Nous avons fait deux hypothèses afin de rendre les résultats plus faciles à interpréter :

- D'abord, nous avons considéré que le volume de la phase stationnaire et de la phase mobile dans chaque plateau est identique. En réalité, ces volumes ne sont pas toujours égaux et dépendent de la colonne utilisée.

- Ensuite, chaque fois que vous cliquez sur 'Pousser la phase mobile', tout le contenu de la phase mobile avance au plateau suivant. Toutefois, dans le modèle développé par Martin et Synge, seulement une fraction infinitésimale de la phase mobile avance au plateau suivant à chaque étape.

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Elution en continu, et simulation du chromatogramme :

Ici vous pouvez observer une animation de vos produits se déplaçant sur la colonne.

Vous pouvez également observer ce qu'un détecteur (comme un spectromètre UV) voit à la sortie de la colonne. C'est ce qu'on appelle un 'Chromatogramme' (appuyez ici si vous souhaitez plus de détails sur les approximations utilisées dans le calcul).

Dans cette application, nous avons considéré que tous les produits induisent la même réponse relative dans le détecteur utilisé à la sortie de la colonne (par exemple, tous les produits possèdent la même absorptivité en UV si le détecteur utilisé est un spectromètre UV).

Pour les calculs, nous avons utilisé une formule approximative proposée par Martin et Synge pour déduire les concentrations sur les plateaux. Cette formule nous permet d'éviter les longs calculs de factorielles présentes dans la formule exacte.

De plus, comme dans le tableau en haut, nous avons considéré que les volumes de la phase stationnaire et mobile dans chaque plateau sont identiques.
Ceci n'est pas vrai pour toutes les colonnes, et un ratio différent donnera un chromatogramme différent, car le ratio v_s/v_m change la constante P (voir plus bas, dans la section sur le calcul du nombre de plateaux).

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Avant de lancer la simulation, il faut préciser quelques informations concernant la colonne et les conditions opératoires :

Volume mort de la colonne (mL) : (qu'est-ce que c'est le "volume mort" ?)

Le volume mort est le volume de la phase mobile à l'intérieur de la colonne. Il peut être calculé par la formule suivante :
Volume mort = volume de la colonne X porosité de la phase stationnaire
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Débit de la phase mobile (mL/min) :

Pour aller plus loin :

Grâce au chromatogramme, et en utilisant la théorie des plateaux, nous pouvons calculer quelques propriétés intéressantes concernant la colonne et les analytes.

Cliquer pour apprendre comment calculer le nombre de plateaux de la colonne, ou les coefficients de partition des analytes.

Comment calculer le nombre de plateaux d'une colonne ? Cacher...

En utilisant un développement mathématique, basé sur une équilibration étape par étape de la concentration dans les plateaux telle que montrée dans le tableau en haut, nous pouvons démontrer^* que le pic chromatographique d'un composé donné suit l'équation suivante :

Un pic chromatographique calculé par la théorie des plateaux n'est pas exactement un pic gaussien. Toutefois, lorsque le nombre de plateaux est important (n >100), le pic chromatographique devient très proche d'un pic gaussien, comme dans les graphiques suivants :

Comme nous savons d'après les cours de statistiques, un pic gaussien est caractérisé par sa moyenne μ et son écart-type σ.

Dans le cas de notre pic chromatographique, nous pouvons montrer^** que l'approximation gaussienne du pic possède les paramètres suivants :

Où P, D et n ont les mêmes significations que plus haut.

En divisant la 1^ère équation par la 2^ème :

En résumé, nous devons connaitre la moyenne μ et l'écart-type σ d'un des pics du chromatogramme pour calculer le nombre de plateaux de la colonne n.

La moyenne d'un pic gaussien est la distance entre le sommet du pic et l'origine de l'axe des X. Toutefois, l'écart-type ne peut pas être mesuré directement, mais peut être estimé en mesurant la largeur du pic à mi-hauteur δ, qui est égale à 2,355 x σ ^***.
Par conséquent :

Cette équation, que vous trouverez dans les livres de références en chimie analytique, permet d'estimer le nombre de plateaux d'une colonne grâce à un chromatogramme.

Vous pouvez utiliser une règle pour mesurer ces paramètres comme dans l'exemple suivant :

Maintenant vous pouvez retourner au chromatogramme obtenu dans la dernière partie de l'application et mesurer le nombre de plateaux. Ensuite, vous pourrez comparer la valeur que vous trouverez avec le nombre de plateaux que vous avez initialement saisi tout en haut de la page.

Références:

* Said AS. Theoretical-plate concept in chromatography. AIChE J. 1956 ; 2(4) : 477-81

** Scott RPW. The Plate Theory of Chromatography. 1^st ed. Integritext UK; 2014

*** en.wikipedia.org/wiki/Full_width_at_half_maximum

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A propos :

Cette application a été développée dans un but pédagogique et s'adresse aux étudiants ayant des cours d'introduction à la chromatographie.

Vous pouvez l'utiliser pour observer le comportement de plusieurs analytes dans une colonne de chromatographie, en fonction du nombre de plateaux de la colonne et de l'affinité de l'analyte étudié vis-à-vis de la phase stationnaire et de la phase mobile de la colonne (le coefficient de partition).

Les calculs utilisés sont basés sur la théorie des plateaux, développée par les inventeurs de la chromatographie liquide/liquide Martin et Synge^*.

Le code de cette application a été écrit par Waël Zeinyeh (Faculté de Pharmacie, Université de Lyon).

L'application a été testée et commentée par Anne Denuzière, Lars Petter Jordheim et Christelle Machon.

Cette application est destinée exclusivement à un usage pédagogique en milieu académique.

* Martin AJP, Synge RLM. A new form of chromatogram employing two liquid phases. Biochem J. 1941 ; 35(12) : 1358–68.